Primer für PCR-Ansätze haben in der Regel eine Länge von 18-30 Nukleotiden. Diverse Biotechnologiefirmen bieten mittlerweile maßgeschneiderte Primer für molekularbiologische Anwendungen an.Die Sequenzen der Primerpaare an den 3`-Enden sollten weder intra- noch intermolekular komplementär sein, damit die Primer nicht mit sich selbst hybridisieren können.Durch Auswahl der Primer werden die zu amplifizierenden DNA-Fragmente bestimmt. Es werden zwei Primer verwendet, die die zu amplifizierenden Anfangs- und Endbereiche festlegen .
Warum erfordert die PCR zwei Primer, aber warum benötigt die DNA-Sequenzierung dann nur einen Primer : „Bei der Sequenzierung wird ein Primer verwendet, während bei der PCR zwei verwendet werden. Wenn wir versuchen, mit zwei vorhandenen Primern zu sequenzieren, erhalten Sie die beiden Sequenzen zurück, übereinanderliegend und völlig unlesbar .“
Wie viele Primer für PCR
Primer. Für jede PCR-Reaktion wird für die beiden komplementären Stränge jeweils ein Primer benötigt, d.h., in die Reaktionen müssen immer Primerpaare eingesetzt werden. Es handelt sich um Oligonukleotide von 18-30 Nukleotiden Länge.
Was sind Primer und warum werden sie in der PCR benötigt : PCR-Primer sind kurze, einzelsträngige DNA-Segmente, die so konzipiert sind, dass sie zum Anfang und Ende der zu amplifizierenden Zielsequenz komplementär sind . Bei einer PCR sind es die Primer, die genau bestimmen, welche DNA-Sequenz kopiert wird.
Die beiden in der PCR verwendeten Primer sollten nicht komplementär sein , da sie sonst aneinander anlagern und ein „Primer-Dimer“ bilden. Wenn in der PCR-Reaktion ein Primer-Dimer vorhanden ist, könnte die DNA-Polymerase das Primer-Dimer amplifizieren, was PCR-Reagenzien verbraucht und möglicherweise die Amplifikation der Ziel-DNA hemmt.
Komplementarität zwischen zwei Primern, insbesondere an den 3'-Enden, kann zur Bildung von Produktartefakten führen, die aus amplifizierten Primer-Dimeren und Primer-Oligomeren resultieren . Die Konzentration der Primer ist bei der PCR viel höher als die der Ziel-DNA.
Wie viele Primer werden in der PCR benötigt
Bei der PCR-Reaktion werden zwei Primer verwendet, die zu gegenüberliegenden DNA-Strängen komplementär sind und mit diesen hybridisieren, wobei einer links (5′) und einer rechts (3′) der zu amplifizierenden Zielsequenz liegt.In jeder PCR-Reaktion werden zwei Primer verwendet, der Vorwärtsprimer und der Rückwärtsprimer , die so konzipiert sind, dass sie die Zielregion für die Amplifikation flankieren. Bei der Denaturierung werden zwei komplementäre DNA-Einzelstränge freigesetzt.Vorwärts- und Rückwärtsprimer werden im Prozess der Polymerase-Kettenreaktion verwendet . Sie binden an den DNA-Strang und steuern ihn zur Verlängerung und Verstärkung.
Wird nur ein Primer verwendet, spricht man von „asymmetrischer PCR“. Es wird nur ein Strang der doppelsträngigen DNA amplifiziert und pro Zyklus wird nur eine neue Kopie synthetisiert, wodurch keine exponentielle Amplifikation erreicht werden kann .
Werden Primer bei der PCR verbraucht : Da in den ersten beiden Zyklen der PEX-PCR-Methode keine Amplifikation stattfindet, wird bei der Reaktion nur eine geringe Menge Primer verbraucht .
Warum sind Primer erforderlich : Ein Primer muss von einem Enzym namens Primase, einer Art RNA-Polymerase, synthetisiert werden, bevor die DNA-Replikation erfolgen kann. Die Synthese eines Primers ist notwendig , da die DNA-synthetisierenden Enzyme, die DNA-Polymerasen genannt werden, neue DNA-Nukleotide nur an einen vorhandenen Nukleotidstrang anhängen können .
Müssen Primer zueinander komplementär sein
Wenn die Primer zueinander komplementär sind, binden sie aneinander statt an die DNA-Matrizen. Daher würde die PCR in diesem Szenario, wenn überhaupt, keine nennenswerte Amplifikation der DNA-Sequenz ergeben. Daher sollten PCR-Primer nicht zueinander komplementär sein .
Um eine beliebige DNA-Sequenz zu amplifizieren , sind zwei Primer erforderlich. Einer heißt „Forward-Primer“ und der andere heißt „Reverse-Primer“. Der Vorwärtsprimer synthetisiert den oberen Strang unter Verwendung des unteren Strangs als Matrize. Während der Reverse-Primer den oberen Strang als Matrize verwendet und den unteren Strang synthetisiert.PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
Da die DNA-Polymerase ein Nukleotid nur an eine bereits vorhandene 3'-OH-Gruppe anfügen kann, benötigt sie einen Primer, an den sie das erste Nukleotid anfügen kann . Diese Anforderung ermöglicht es, einen bestimmten Bereich der Matrizensequenz abzugrenzen, den der Forscher amplifizieren möchte.
Wie viele Primer werden bei der PCR benötigt : Bei der PCR-Reaktion werden zwei Primer verwendet, die zu entgegengesetzten DNA-Strängen komplementär sind und mit diesen hybridisieren, wobei einer links (5′) und einer rechts (3′) der zu amplifizierenden Zielsequenz liegt.